Técnica de Edición Epigenómica

Existen fármacos que están aún en estudio y se basan en modificaciones epigenómicas. A pesar de numerosos estudios, muchos aspectos asociados con la transcripción y la replicación del genoma viral permanecen sin explorar. El conocimiento fundamental sobre estos temas es necesario para mejorar la eficacia de la vacuna, el descubrimiento de fármacos antivirales y las herramientas de diagnóstico para protegerse de una nueva pandemia grave provocada por una influenza patógena.IAV es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo.

·         Tema: Dirigirse al entorno de la cromatina de la transcriptasa del virus de la gripe para interferir con el ciclo del virus - FluChromatin.

• Mecanismo epigenómico tratado: metilación de Histonas
  
  
• Cómo se lo hizo:  la maquinaria de transcriptasa del virus de la Influenza A (IAV) se dirige a la cromatina, para explorar el impacto global del virus en la estructura de la cromatina del huésped
  
  
• Resultados: Permitió obtener información preliminar sobre el efecto de una selección de Epi-fármacos en el ciclo viral

BIBLIOGRAFÍA:

Delmas M. Targeting the chromatin environment of the influenza virus transcriptase to interfere with the virus cycle | ANR [Internet]. Agence nationale de la recherche. 2017 [cited 11 January 2020]. Available from: https://anr.fr/Project-ANR-17-CE18-0006

Ejemplo de Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos

El virus de la gripe A facilita su infectividad al activar p53 para inhibir la expresión de proteínas transmembrana inducidas por interferón

En este estudio revelan que la activación de p53 por el virus de la influenza A es un paso esencial para mantener su infectividad, de modo que si se inactiva p53 mediante técnicas de edición genómica como CRISPR/Cas9, aumenta la expresión de proteínas transmembrana inducidas por IFITM y por tanto se bloquea la entrada del virus de la gripe a las células.  

Tema: El virus de la gripe A facilita su infectividad al activar p53 para inhibir la expresión de proteínas transmembrana inducidas por interferón, esto se puede modificar mediante técnicas de edición genómica

Tipo EG: Somática ex vivo (in vitro)

Dirigida a: Modificaciones de ADN en el locus TP53 de células pulmonares A549

Dirigido por: Tecnología CRISPR/Cas9 – p53 knochout se diseñaron secuencias de RNA mono guía (sgRNA) dirigidas a P53.

Órgano/ sistema/ tejido/ célula:

Pulmón: Células pulmonares susceptibles al virus influenza

Vía de administración: No se realizó administración in vivo. El procedimiento se realizó únicamente ex vivo a través del cual las células A 549 se transfectaron con las secuencias sgRNA usando reactivo Lipofectamine 2000.

Resultados:

Corto plazo: Usando células humanas p53 de tipo natural se generó células p53 null mediante CRISPR/ Cas9, cuyo estudio determinó que las ultimas muestran una propagación viral reducida.

Medio plazo: Se debería realizar estudios posteriores, utilizando además de la técnica ex vivo también técnicas in vivo.

Largo Plazo: Determinar cuáles son los efectos secundarios que podrían producirse.

BIBLIOGRAFÍA:

Bei W, Tze H,  Mun K, Zhiyong Y, Jinmiao C, y Ee Chee R, El virus de la influenza A facilita su infectividad activando p53 para inhibir la expresión de proteínas transmembrana inducidas por interferón [Internet]. pubmed.com. 2018 [cited 04 enero 2020]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5990591/

Terapia Regenerativa con Stem Cells en la Influenza

Terapia Regenerativa con Stem Cells en la Influenza

Las células madre distales que expresan p63 (+) Krt5 (+) son esenciales para la regeneración pulmonar en respuesta al daño pulmonar inducido por la influenza.

Tipo de Stem Cells:

Somática: células madre distales de las vías respiratorias (DASC p63 / Krt5 y TBSC p63 / Krt5)

Método de Obtención:

• Aislar las células madre de las vías respiratorias, se recogieron de la tráquea (TBSCs) y del pulmón (DASCs) de ratones adultos y se sumergieron en tampón de lavado en frío (medio F12, 1% Pen / Strep, 5% FBS).
• Se digiere con tampón de disociación (F12 / DMEM, 1mg de proteasa ml, 0,005% de tripsina y 10 ng ml21 de ADNasa I)
• Las células disociadas se cultivaron en células alimentadoras 3T3 irradiadas
• Las colonias de células individuales fueron recogidas mediante anillos de clonación.
• Células de TBSCs y DASCs diferenciados in vitro
• Para activar los genes (lacZ) en TBSCs y DASCs clonados se expuso las colonias in vitro a 4-OH-tamoxifeno
• Trasplante de células madre en el pulmón en ratones adultos

Resultados:

A corto plazo se logró generar colonias de células madre distales de las vías respiratorias con autorenovación a partir de tres ratones de 0 dpi

A medio plazo se espera propagar la capacidad de estas células manteniendo su compromiso de linaje intrínseco trabajando con células humanas.

A largo plazo se proyecta terapias basadas en células madre para enfermedades pulmonares agudas y crónicas.

BIBLIOGRAFÍA:

Zuo W, Zhang T, Wu DZ, Guan SP, Liew AA i, p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration.

, [Internet]. Nature.com. 2016 [cited 29 December 2019]. Available from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Distal+stem+cells+expressing+p63+(%2B)+Krt5+(%2B)+are+essential+for+lung+regeneration

Transgénico para Neumonía por virus de la Influenza

Los pollos transgénicos que expresan la proteína de fragmento variable de cadena única 3D8 suprimen la transmisión de la influenza aviar.

Se realizó modificaciones genéticas para controlar la IA en aves de corral, mediante la introducción de un gen personalizado para una mayor afinidad por las nucleoproteínas de la IA. Generando una una línea de animales transgenicos que expresan un gen. Los embriones de pollo knock-in se microinyectaron con un vector lentiviral scFv-HA-IRES para generar pollos transgénicos, gen scFv 3D8 bajo el control del promotor de la β-actina de pollo.

Uso:

El experimento de desafío reveló que los pollos transgénicos expuestos al contacto que expresaban scFv 3D8 exhibían una eliminación viral suprimida. Estos resultados sugieren que los pollos transgénicos desarrollados en este estudio podrían ser útiles para controlar la posible transmisión de AIV dentro de la bandada.

Análisis de transferencia Southern de los pollos transgénicos. Se extrajeron muestras de ADN genómico de muestras de sangre completa de pollos de tipo salvaje y transgénicos (G1 y G2), se digirieron con EcoRV, se sometieron a electroforesis

5 Ventajas y 5 Desventajas de los Transgénicos.

VENTAJAS	DESVENTAJAS
1.        Control de vectores	1.       Reducción de eficiencia en antibióticos
2.       Creación de fármacos y vacunas	2.       Alergias, intolerancias y enfermedades autoinmunes
3.       Alimentos con mayor carga nutritiva	3.       Invasión de ecosistemas
Desarrollo de biomodelos para evaluación de nuevas terapias y patogenia de enfermedades	4.       A largo plazo las plagas generan resistencia
5.       Mayor resistencia a los insectos	5.       Modificación genética de virus dando lugar a nuevas enfermedades

BIBLIOGRAFIA:

 Byun S , Yuk S , Jang Y , Choi J , Jeon K , Pollos transgénicos que expresan la proteína del fragmento variable de cadena sencilla 3D8 suprimen la transmisión de la gripe aviar [Internet]. Nature.com. 2017 [cited 18 December 2019]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5517518/

Wang S, Chen C, Yang Z, Chi X, Zhang  J, Chen Ji, Targeted disruption of influenza A virus hemagglutinin in genetically modified mice reduces viral replication and improves disease outcome, [Internet]. Nature.com. 2016 [cited 18 December 2019]. Available from: https://www.nature.com/articles/srep23746

Reyes M, Rozowski J, Alimentos transgénicos, [Internet].scielo. 2016 [cited 18 December 2019]. Available from:  https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-75182003000100003

La producción de "VACUNAS RECOMBINANTES CONTRA LA INFLUENZA", como el FLUBLOK   que se da mediante la extracción de células del gusano cogollero del maíz alterando la producción de HA, que es la proteína más inmunogénica, capaz de originar una respuesta protectora contra la influenza, luego, esa proteína se expresa en un sistema heterólogo, donde el insecto manifestando el gen que pertenece al virus. con el  ADN recombinante ya no es necesario manejar el virus de la influenza vivo.

BIBLIOGRAFÍA:

1. Griffiths A, Miller J, Suzuki D, Lewontin R, Gelbart W. Transduction [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2019 [cited 14 December 2019]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21760/?redirect-on-error=__HOME__
2. Los CDC confirman un 6° y 7° caso de virus de la influenza A H3N2 de origen porcino con el gen M del virus H1N1 2009 [Internet]. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Centro Nacional de Vacunación y Enfermedades. 2011 [cited 10 December 2019]. Available from: https://espanol.cdc.gov/enes/flu/spotlights/swine-origin-indiana.htm
3.  Intención de recibir la vacuna monovalente contra la influenza A (H1N1) 2009 y la vacuna contra la influenza estacional --- Dos condados, Carolina del Norte, agosto de 2017 [Internet]. Cdc.gov. 2017 [cited 14 December 2019]. Available from: https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5850a1_ensp.htm
4. Palomares L. UNAM-IBT. Dra. Laura Palomares. LAMMB. Vacunas Recombinantes [Internet]. Youtube.com. 2018 [cited 14 December 2019]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=nrLChKIcQA0&feature=youtu.be

Recombinación de ácidos nucléicos que suceden en la naturaleza (sin que haya intervenido la manipulación humana)

ADN recombinante permite introducir en el ADN de un organismo un fragmento de interés procedente de otro organismo donante. Permitiéndonos identificar genes y productos que median la inmunidad y resistencia a medicamentos, transferidos por genes o formas mutadas de los genes en agentes causales o huéspedes sustitutos, por fásmidas lanzadera, moléculas quiméricas que se replican en E. coli como plásmidos y en micobacterias como micobacteriófagos, actúa en el desarrollo de sistemas de transferencia génica

BIBLIOGRAFÍA:

1. Ping X e. Generation of a broadly reactive influenza H1 antigen using a consensus HA sequence. - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2019 [cited 5 December 2019]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29960799
2. Jacobs W. Transferencia génica en Mycobacterium tuberculosis : Phasmids del transbordador a la iluminación [Internet].  cbi.nlm.nih.gov. 2014 [citado 5 Diciembre 2019]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4725585/

Secuenciación de microarrays de miARN: Están expresados ​​exclusivamente en los virus con potencial de capacidad infecciosa humana, determinando la expresión de 4 miRNAs (hsa-miR-96-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-30a-3p y hsa-miR-582-5p) y 5 mRNA relevantes (RCC1, ERVFRD-1, RANBP1, SCARB2 y RPS29) . 

El microarray de miARN y el análisis cuantitativo por PCR mostraron que varios miARN, encontró que miR-21-3p que promueve la virulencia.

BIBLIOGRAFÍA:

1. 1.   Xia B , Lu J  , Wang R  , Yang Z  , Zhou X  , Huang P . Integration analysis of a miRNA-mRNA expression in A549 cells infected with a novel H3N2 swine influenza virus and the 2009 H1N1 pandemic influenza... - PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2019 [cited 31 December 2019]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31207403
2. 2.    Xia B , Lu J  , Wang R  , Yang Z  , Zhou X  , Huang P. miR-21-3p Regulates Influenza A Virus Replication by Targeting Histone Deacetylase-8. PubMed - NCBI [Internet]. Ncbi.nlm.nih.gov. 2019 [cited1 1 December 2019]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29888214